CHO细胞工程的艺术:全面回顾与展望

栏目:博客 来源:海南在线 时间:2019-09-22

摘要:中华仓鼠卵巢细胞(CHO)是治疗性重组蛋白工业化生产的主要宿主细胞。CHO细胞能够生产高质量的生物制剂,其与人相似的翻译后修饰水平能够达到克级。然而,利用动物细胞生产生物药的过程仍然遭受许多制约,如生长限制、低产率、低耐压以及与大肠杆菌的酵母表达系统相比的高成本。除了生物过程、培养基以及载体的优化之外,先进的宿主细胞工程技术已经在CHO细胞系发展中展现了卓越的成效,如工程基因的引入、敲出、翻译后沉默。此外,通过对细胞代谢途径以及对生物过程重要的机制分析,运用基因组学工具,逐步揭开新靶点用于建立优秀的生产用细胞工厂。本综述全面总结了过去三十年中CHO细胞工程的主要基础性成就。最后,作者讨论了新颖方法论对加强基于CHO生产平台的生物药物生产的潜能。

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介绍

生物制药在制药行业所占比重日益增加,并且在未来数十年中,市场对生物制品的需求也在不断增加。由此而论,大多数符合工业要求的用于表达重组蛋白的生产细胞株就显得尤为重要。重组蛋白的有效性和免疫原形直接与翻译后修饰(PTMs)相关。动物细胞系是优先选择的表达系统,并且如今60%-70%的生物药物是基于动物细胞培养过程而来。并且,相较于以微生物和酵母作为宿主细胞的生产过程,动物细胞表达系统在细胞生长、培养时间以及产率方面仍有很多瓶颈。

用于生物药物生产的CHO细胞工厂的稳步发展,是在满足治疗性蛋白日益增长的需求方面的关键挑战。医疗对生物药物日益增长的需求,使得医保系统面临着极大的花费。生物药物工业化生产与不昂贵和高产的细胞生产平台高度相关,以此得到产率最大化同时降低相关费用。因此,全新的策略已经发展并被应用到动物细胞培养过程,以满足成本效益和有效的高产。一般会有不同的方法来抵消动物细胞工厂的限制。生物过程和培养基的优化,可以得到生长特性的提高,从而导致细胞增殖的提高和/或者最大活细胞密度(VCD)的提高。此外,通过基因工程的手段来提高CHO生产细胞株的性能,已经是被大量应用于细胞工厂的方法。这种方法一般包括优势基因的过表达或者通过基因敲出以及siRNA介导的敲出技术来抑制不利基因的产物。值得注意的是,非编码RNAs目前已经成为最先进的细胞工程技术,在未来细胞系的发展中展现出革命性的极大潜力。这些成就能够使CHO细胞改造柱在生长、细胞凋亡抑制、新陈代谢、产率以及表达糖基化重组蛋白的能力方面胜过它们的母细胞株(Fig 1)。因此,宿主细胞工程在显著提高基于CHO细胞生产过程的有效性方面,代表了一种强有力的技术。接下来的三章主要讲述了在过去三十年中CHO细胞工程功能性基因组学方法的全面概括。此外,我们同样介绍了那些能够增强CHO细胞性能从而在未来建立出众的高产生产过程的最新和最前沿的技术。

1: CHO细胞工程的功能性基因组学

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中华仓鼠卵巢细胞

相较于其他细胞类型,CHO细胞是治疗性蛋白生产的主要宿主细胞的原因如下:(1)能在化学成分限定和无血清悬浮培养中稳定生长,(2)在人类致病病毒应答方面表现出合理的安全性,(3)能够表达与人相似的翻译后修饰。此外,CHO细胞表达系统的最重要优势之一是能够容易的得到基因改造的细胞克隆,这些克隆能够表达产量充足和质量可接受的人用目标基因(GOI)蛋白。这些既可以通过将目的基因特异性位点整合插入到宿主细胞基因组中,也可以通过二氢叶酸还原酶(DHFR)和谷氨酰胺合成酶(GS)系统的基因扩增方法将基因随机整合到宿主细胞基因组中。然而,因为糖基化模式与人类不完全相同,导致CHO细胞产生的重组蛋白在某些时候仍然表现出免疫源性。

包含多种不同细胞株的全部“CHO细胞系统”都可能来自于1956年由Theodore Puck分离的具有无性繁殖性和自发永生性的中华仓鼠卵巢细胞。第一株CHO细胞以及随后产生的细胞株都有合成性能方面缺陷,这一事实支持了它们来自于同一个克隆的猜想。时下,有三株不同的细胞株被广泛用于生物药物的生产中:(1)带有功能性DHFR基因的CHO-K1细胞系,(2)DHFR单等位基因敲除的CHO-DXB11细胞系,(3)DHFR双等位基因物理删除的CHO-DG44细胞系。

在2011年,Xu及其工作伙伴将第一个CHO基因组测序,这显著加速了生物技术在研究成果上的应用。然而,因为CHO细胞极容易基因重组,进一步的测序成果包括可预测的染色体排序,是在基因组学领域得到更详尽概述的必要条件。除了基因组学信息外,近来转录组、小RNA组(miRnome不知翻译对否)以及蛋白组/翻译组数据也成为可能。最近,转录起始位点被解开,一旦这些起始位点在CHO基因组数据库(www.chogenome.org)中可以公开查阅,人们将会得到更多更详尽的生物学信息学的分析。总体上,所有这些有价值的贡献都有助于我们更好的描述生物技术的主导部分,以及对细胞工程中研究成果的全面支持。

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CHO细胞工程

3.1 工程基因介绍

利用目的基因的稳定整合来提高动物细胞系性能的技术已经有超过25年的开发历史(Fig 2A)。一般的,当一个有优势的目的基因被发现后,其(一般是密码子优化)缺乏任何内含子的互补DNA(cDNA)会被分离,并且被克隆到一个动物细胞表达系统的载体上。接下来传递质粒DNA(pDNA),被转染的细胞需要经过抗生素选择性压力来得到已经将质粒DNA稳转到基因组上的细胞池。为了保证目的基因的高拷贝,它的表达主要依赖于强病毒或者细胞启动子/加强子,然而标记基因一般通过弱启动子来增加整个表达水平。所选择的细胞培养是一个异质性的细胞混合池,它表现出多种范围的转染基因的过表达,并且导致个体细胞的不同表型。因此,需要从细胞池中挑选出那些具有高拷贝和稳定构建表型的单细胞克隆。一份关于通过优势目的基因成功实施CHO细胞构建方法的清单列在表1中。

2: CHO细胞中通过基因工程得到的细胞功能性目标位点.

3.1.1涉及糖基化基因的过表达

虽然用CHO细胞生产的治疗性蛋白主要用于人类,并且要考虑其安全性,它们可能只表现出与人相似但并不能被人体识别的翻译后修饰(PTMs)。然而,不正确的N-糖基化模式可能导致一些免疫反应,并且可能导致单克隆抗体(mAbs)的抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)减弱。因此,糖基化状态严重影响重组蛋白的性能,比如血清半衰期,稳定性,免疫源性和其在人体中的功能性。不同的基因工程策略已经被用于调整CHO细胞生产的重组蛋白的糖基化模式。相较于人细胞和鼠细胞,CHO细胞缺乏α-2,6-唾液酸转移酶(ST6GAL)但是只表达α-2,3-唾液酸转移酶(ST3GAL)。因此,CHO细胞天生不能产生与人类细胞系相似的末端唾液酸丰度。随着对治疗性蛋白复杂糖基化的需求日益增多,使研究人员在1989年就构建出了稳定过表达ST6GAL的CHO细胞株。这种构建过的细胞株能够分泌含有α-2,6-唾液酸糖苷残基的重组蛋白。其他被确认过表达ST6GAL基因的多种物种(人,小鼠,大鼠)确实能够增加重组蛋白N-糖苷的唾液酸的丰度。包括N-糖基化通路中不同部分的基因共同导入的工程方面的进一步的努力,使得治疗性重组蛋白的N-糖苷结构得到提高。这些包括如不同的N-乙酰基葡萄糖转移酶(GnT-III, IV和V),尿嘧啶二磷酸-N-乙酰基葡萄糖2-异构酶(GNE),CMP-唾液酸合成酶(CMP-SAS),高尔基α-甘露糖苷酶II(ManII)或者GDP-6-脱氧-4-己酮酶还原酶(RMD)。最后,虽然在过去十年人们将主要的注意力都集中在重组蛋白的N-糖基化上,改变方向的对O-糖基化的研究表明其在CHO细胞中对功能基因代谢工程方面的潜在影响。然而,虽然N-糖基化的调整在重组蛋白治疗潜能和安全性方面占据主导作用,对O-糖基化调整的进一步研究仍然不够详尽。

3.1.2通过基因过表达提高细胞代谢

细胞新陈代谢相关的基因被作为目的片段通过基因工程的手段转入细胞中,以此来提高CHO生产细胞的性能。二十年前,通过过表达特定的基因来改变CHO生产细胞的新陈代谢活性,这将延长培养周期,提高产物得率。Pendse和Bailey报道,加强CHO细胞透明颤菌血红蛋白(VHb)的表达已被证明能够将人组织纤溶酶原激活剂(tPA)活性提高40-100%。几年后,其他研究组的贡献拓展了代谢工程基因的范围,这些基因的过表达可以优化CHO细胞在培养基中的营养物消耗以及代谢副产物的累积。值得注意的是,除了优化了工程CHO细胞的代谢活性外,大部分所提到的研究表明培养基利用率的提高到带来产物得率的提高。

3.1.3 通过抗凋亡和促增殖基因的过表达提高培养性能

在癌症研究中,凋亡是一种十分好的特征性细胞通路,凋亡性细胞死亡的逃逸是癌细胞的特征。然而,在生物过程中削弱细胞凋亡,这将是十分有益于延长培养时间从而增加单位体积的产率。一些研究组已经成功证明,抗凋亡基因的过表达对CHO工程细胞的基因改造是有利的。启发于B细胞淋巴瘤稳定细胞工厂的天然蓝图,Majors等人最近试图通过过表达B细胞淋巴瘤XL(BCL-XL)的变异体来找到一种完善抑制细胞凋亡的策略。除了使用天然和突变的BCL-XL,研究者也利用其他一些抗凋亡基因如B细胞淋巴瘤2(BCL2),X连锁细胞凋亡抑制蛋白(XIAP),细胞凋亡半胱天冬酶抑制剂(AVEN),Fas凋亡途径抑制剂分子(FAIM),骨髓瘤细胞白血病1(MCL1)等(详见表1)来提高培养周期,他们主要的作用机制是抑制由于培养后期营养缺乏和代谢副产物累积导致的细胞凋亡。值得注意的是,死细胞数与产物的损失直接相关,这些非活细胞会在培养后期释放蛋白酶以及其他一些过程酶到培养液中,最终导致产物质量问题。最终,抗细胞凋亡工程具有极大的潜能,通过抑制胞外蛋白酶的增加来保证生产后期产物的高质量。

除此之外,培养后期的饥饿状态也会导致CHO细胞的自我吞噬。自我吞噬是细胞利用自身细胞器和其他细胞成分来产生能量的过程。CHO细胞工程方法要同时关注自体吞噬和细胞凋亡途径从而提高细胞活性和培养时间,并且已经报道可以通过AKT或者BCL2和BECLIN1联合过表达的方法实现。然而,单独通过过表达自体吞噬核心通路基因ATG9A的策略已被证明不能够影响自体吞噬,并且这种努力并不能增加CHO细胞重组蛋白的得率。虽然自体吞噬作用在生物过程中扮演了一个重要的角色,因此它成为CHO细胞中极具希望的目标位点,其分子组成也在通过进一步的实验进行研究。然而,这甚至可能有助于发现适合CHO细胞使用基因工程进行基因调控的新目标位点。

通过加速细胞扩增来缩短细胞生长周期,一般伴随着比生长速率的逐渐下降,这个过程可以通过基因工程实现。以比生长速率的提高为特点的细胞量的快速积累支持着生产期的延长。与此同时,Doolan及其同事证明含缬酪肽蛋白(VCP)的强制表达能够加强CHO生产细胞的增殖和活性。此外,其他侧重于细胞周期的基因工程策略已经被用于提高重组CHO细胞的生长速率。细胞周期蛋白依赖性激酶3(CDKL3)和细胞色素C氧化酶亚基(COX15)的共同过表达可以提高最大活细胞密度(VCD)。Kuystermans 和AI Rubeai利用骨髓瘤细胞致癌基因的过表达,在不添加营养物的条件下使得CHO细胞最大细胞密度提高70%。有趣的是,其他的研究证明即使阻断细胞周期的进行也会导致有益的影响,并且细胞周期抑制剂如p21CIP1或者p27KIP1的过表达会导致细胞周期的阻断但是却增加了CHO细胞的比生长速率。

3.1.4 加强基因表达提高细胞产率

最终,稳定基因组的导入促进了蛋白的生产,通过加强细胞蛋白合成组件或者分泌组件的基因表达可以增加CHO细胞培养中重组蛋白的得率。过表达转录因子如ZFP-TF,ATF4或者GADD34被证明可以将多种细胞重组蛋白的产量大幅度提高,甚至相较于母细胞提高10倍。另一种蛋白合成中的关键蛋白是哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(mTOR)。加强mTOR异位基因表达大幅度提高了重组CHO细胞的全部培养性能,导致细胞生长、活性、细胞凋亡抑制和比生产速率的提高。

值得注意,随着对复杂和难表达的治疗性蛋白需求的增加,优化策略需要提高以提供满足临床研究和市场需求的充足产品。Pybus及其同行最近报道了一种有趣的方法,其证明共同过表达热休克蛋白70kDa 5(BIP),活化转录因子6C(ATF6C)以及X-box结合蛋白1(XBP1)能够增加难表达单抗的产率。另一个解决难表达重组蛋白产率低的策略是Le等人报道的,他们过表达人信号受体蛋白14(SRP14)以此构建CHO细胞的分泌能力并且成功提高了蛋白产量。基因工程进一步的努力方向是分泌途径,已经得到一些分泌途径中能够提高蛋白分泌速率且令人兴奋的概念。蛋白二硫键异构酶(PDI),X-box连接蛋白1(XBP1),神经酰胺转移蛋白(CERT),23 kDa突出体连接蛋白(SNAP23),囊泡连接膜蛋白8(VAMP8)或者其中的某些组合被证明能增加重组蛋白的产量。

3.2 基因敲出

除了将能够有利于CHO生产细胞性能的目的基因过表达外,将不利基因组敲除也可作为改造宿主细胞的有效策略。有很多不同的方法可以从基因组中删除某个基因,或者说将其功能关闭,如通过化学、放射诱导的随机突变或者基因编辑定向突变的方法。定向基因工程拥有极高的特异性,因此优于随机突变,特别是对于某一点的调节。同时,当今最先进的技术包括锌指蛋白核酸酶(ZFNs),类转录激活剂效应物核酸酶(TALENs),大范围核酸酶或者最近发现的基因编辑技术(CRISPR/Cas9)系统。对目标基因或者通路使用基因编辑技术来提高CHO细胞工厂的全面概述列于表2

历史上,使用基因操纵技术在利用CHO细胞表达生物药物生产中取得经济性效益的最重要之一的技术就是二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的敲除/失活。虽然这些基因操作是通过化学突变和电离辐射得到的,不同的DHFR-缺陷株CHO细胞分别被定义为DXB11和DG44,它们是CHO细胞在生物技术领域商业化的始发性标志。之后,另一个适合扩增的是基于谷氨酰胺合成酶(GS)系统,它能够受到蛋氨酸二甲基代砜(MSX)的抑制,使高表达重组CHO细胞得以产生。整个适合于代谢挑选和基因扩增的CHO-GS细胞工厂,被CHO-K1SV的产生所扩增,而其来自于内源性基因GS基因的敲除。如果细胞之前曾转染过含有DHFR或者GS基因的质粒拷贝,CHO-DXB11/DG44和CHO-GS细胞能够分别通过稳定的转染子在不含次黄嘌呤/胸腺嘧啶和L-谷氨酰胺的培养基中得以挑选。更重要的是,稳定转染的细胞在不断加压下能够进行基因扩增,二氢叶酸类似物氨甲喋呤(MTX)是CHO-DXB11和CHO-DG44的筛选压力,蛋氨酸二甲基代砜(MSX)是CHO-GS的筛选压力。

3.2.1 通过促凋亡基因的敲除抑制细胞死亡

与上述讨论的抗凋亡基因的加强表达相似,对促凋亡基因的抑制也是稳定提高动物细胞培养性能的方法(Fig 2B)。永久性去除CHO细胞中BCL2-关联X蛋白(BAX)和BCL2-拮抗物/断路器(BAK)的表达,使用锌指蛋白核酸酶通过抑制胱天蛋白酶活性(细胞凋亡核心酶)增加细胞凋亡抑制。这最终使单克隆抗体产量提高五倍,强调了细胞凋亡工程在重组CHO细胞中的潜能。

3.2.2 通过基因编辑调节重组蛋白的翻译后修饰

由于PTMs在治疗性蛋白中占有重要的性能,其控制就显得越来越重要。在提高CHO细胞生产重组蛋白的糖基化性能时所使用的不同工程方法,涉及糖基化的不同目的基因已经做了敲除研究。缺少核心岩藻糖的单克隆抗体在极低浓度下就有很强的ADCC反应。同源重组介导了稳定的α-1,6-岩藻糖转移酶(FUT8)的基因组敲除,该酶可以催化核心岩藻糖转移到抗体的Fc片段,从而在CHO细胞培养中消除FUT8活性。相似的,Malphettes等人利用基于锌指蛋白的基因编辑技术将FUT8基因从基因组中敲除,得到了FUT8缺陷型CHO细胞株。最近另有研究人员将FUT8基因敲除的同时引入了抗体表达组件基因,以此来研究CHO细胞中联合敲除/敲入技术策略的功能性。利用锌指核酸酶的技术联合敲除两个不同的糖基转移体重要基因GDP-岩藻糖(SLC35C1)和CMP-唾液酸(SLC35A1),得到一株岩藻糖和唾液酸含量低的工程CHO细胞。CHO细胞中N-乙酰葡萄糖转移酶的基因敲除已被证明能够产生Man5作为主要糖基化位点的糖蛋白。干扰其他一些糖基化通路的基因被视为改造CHO细胞使其表达特定糖型重组蛋白的一种有前途的策略。Yang及其同事最近提供了一种令人印象深刻的例子,他们利用锌指核酸酶技术敲除了重组CHO细胞中19种不同的糖基化基因,通过新型“设计CHO细胞”生产预定义糖型的糖蛋白。作者很好的诠释了通过组合基因组编辑技术进行多种敲除组合能够得到预期中糖基化属性的重组蛋白,因此该基因工程技术未来有望成为热点。

另一个翻译后修饰氨基酸残基影响着单克隆抗体的多变性,因此他们的质量就是CHO细胞产单克隆抗体C端酰胺化种类。Skulj等人最近演示ZFN-介导的CHO细胞中肽酰甘氨酸α-酰胺化单氧酶基因敲出,使单抗C端酰胺化明显减少,得到更加均已化的产物。

除了用于治疗性的重组蛋白,其他使用基因工程的研究已将目标定为得到特定类型糖基化的用于研究的蛋白。例如,拥有简单均一化的糖链异质体被期望用于X-射线晶体解析进行结构分析。与此同时,Sealover及其同事敲除了CHO细胞中甘露糖(α-1,3-)-糖蛋白,β-1,2-N-乙酰葡萄糖转移酶(MGAT1),得到以甘露糖-5(Man5)为主要N-连接糖基化种类的重组蛋白。相较于前面关于利用化学突变法删除MGAT1基因的报道,ZFN-介导的MGAT1基因敲除在细胞特性如生长或者活性方面并没有消极影响。这都支持一种观点:精准基因编辑技术相较于化学和物理突变具有更可观的优势。

3.2.3 CHO细胞使用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行复合表型敲除

使用CRISPR/Cas9的精准基因编辑技术最近被引入CHO细胞工程中进行基因敲除,显得更易构建、更节省时间并且成本更低。因此,这项创新性方法无疑在当今细胞株的优化方面带来革命性的改变,使动物细胞工程实现理论设计。CRISPR代表着微生物适合的免疫防御机制,保护细胞免于外源核酸的破坏。几年前,CRISPR/Cas9系统已被证明可以在真核细胞中作为基因编辑工具起作用,其已在多种模型生物体和真核细胞中成功应用该。CRISPR关联Cas9基因的产物是一种RNA介导的内源性核酸酶,并且代表着该系统能够催化DNA分裂。Cas9通过小向导RNA靶向基因组中特定的靶位点,其包括反式激活RNA(tracrRNA)和CRISPR-RNA(crRNA),共同形成嵌合sgRNA复合体。crRNA序列是基因组靶向DNA序列的互补序列,因此决定了其特异性。因此,它额外需要靶点位于带有两个鸟氨酸的前间区序列毗邻基因(NGG)旁边。一旦CRISPR/Cas9-sgRNA核苷核酸蛋白复合体能够识别靶点,它就会从PAM元件的上游3个bp开始打开双链,而PAM元件一般通过非同源性末段接合进行修复(NHEJ)。通过NHEJ的DNA修复经常导致DNA碱基的插入和删除,造成读框移位使各自的基因失去功能。

这将使得CRISPR/Cas9系统在CHO细胞工程中极其有利,以更加快速的产生具有优势特征的完美细胞系。第一份关于CHO细胞中使用CRISPR/Cas9工具进行精准基因编辑的报告中提及了O-糖基化和N-糖基化途径中COSMC和FUT8这两个基因的基因破坏。此外,一个被称为“CRISPy”的新型网络生物信息工具也已问世,它能够设计自定义sgRNA序列以达到敲除其他基因的目的。最近,Grav和他的同事们证明了CRISPR/Cas9能够快速的一步敲除多个表现性。将Cas9转染到基于荧光功能的细胞中能够超高频且目标专一的同时破坏FUT8,BAX和BAK。该研究明确强调了CRISPR/Cas9较TALEN或是ZFN在CHO细胞中进行多基因编辑以快速高效的创造合理的“设计师CHO细胞工厂”的优势。

3.3 RNAi介导的基因沉默

自从在秀丽新小杆线虫中发现了RNA干扰,双链RNA,也称为携带RNA介导的基因沉默(基因拆卸)已经成为了一种细胞工程中高频运用的技术。siRNA是具有20-25个碱基对的双链RNA,展示了对目标信使RNA完整的序列互补。外源导入的siRNA被RNase-III解旋酶解链并结合在Argonaute-2蛋白上,形成细胞质中RNA诱导的沉默复合物(RISC)的核心。AGO2仅代表AGO蛋白家族中具有切割能力的蛋白,目标信使RNA一旦被siRNA结合,AGO2随即降解mRNA。双链RNA的5’-末端的热力学稳定性决定了哪条链作为指导链。尽管siRNA介导目标基因沉默是人为的,但是最近有研究表明真菌中天然存在siRNA介导目标基因沉默,这都是由于转座子转录,重复序列,长loop结构或是转录-反转录等内源因素导致的。

3.3.1 抗凋亡基因的降低可改善细胞培养情况

在CHO细胞中,siRNA已被广泛用于具体基因沉默来改善细胞凋亡、糖基化、代谢或具体生产途径。图2C总结了因siRNA介导的基因沉默而下调的最重要的目标基因,以提高CHO生产细胞的细胞性能。siRNA可以作为小的双链RNA直接导入到细胞质中,或者由含有载体的小发卡RNA表达,由上述提到的内源性RNA干扰机制首先将siRNA解链形成单链的siRNA。细胞凋亡是一种极其重要的细胞过程,通过调节不同凋亡途径关键蛋白来进行改善。在养分枯竭或高渗透压的介质中,稳定的siRNA介导的促凋亡基因的下调,例如BAX和BAK,已被证明可以延长CHO细胞的寿命。从而在流加培养过程中获得更高的活细胞密度,并提高了最终干扰素(IFNγ)的产量。在另一个不同的方法中,胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7都沉默了,并且考察了siRNA介导设计的CHO细胞在丁酸钠处理过程中表现。在1毫摩丁酸钠的条件下,工程细胞显示出更高的活性和更长的培养时间,从而使得人类血小板生成素(hTPO)的产量提高了55%。Wong及其同事们在CHO细胞中对转录组进行分析研究,识别了4个早期凋亡信号基因在培养后期过程中表达的差异。REQUIEM和ALG2这两个促凋亡基因被siRNA稳定下调且该工程细胞显示出比CHO母细胞系更高抗细胞凋亡能力,从而大大提高了活细胞密度和终产物IFNγ的产量。

3.3.2 通过基因敲除调控转录后修饰

与稳定基因FUT8的基因敲除相似,Mori等人报道了由抗FUT8siRNA介导的FUT8信使RNA80%的下降可至少降低60%的单抗的岩藻糖基化,获得提高了100倍的ADCC。此外,FUT8结构上的敲除去除了88%的去岩藻糖基化的抗胰岛素生长因子-1受体抗体在产量上的负作用。与糖基化途径的其他基因相关的功能缺失研究表明GMD蛋白表达的减少明显优于FUT8基因敲除并产生了完全的非糖基化的单抗。最后,FUT8和GMD的联合敲除也形成了ADCC加强的完全去糖基化的单抗。

另一个重要的PTM是唾液酸糖化作用。去唾液酸化的血清糖蛋白的循环半衰期明显比唾液酸化的组分低得多。因此,改善唾液酸化作用是治疗用蛋白生产的一个重要因素。CHO细胞中siRNA介导的唾液酸酶的下调降低了至少60%的活性。Ngantung及其同事能够选择CHO细胞系,该细胞系能够保留重组IFNγ完整的唾液酸组分直到批培养结束。通过NEU1和NEU3这两个唾液酸酶基因的沉默,唾液酸酶活性降低了98%,使得唾液酸含量增加了约23~33%。

3.3.3 代谢关键酶的下调改善了CHO细胞中重组蛋白的产量

真核表达系统的一个主要问题是培养环境随着乳酸的积累而逐渐变酸,乳酸是丙酮酸经乳酸脱氢酶(LDH)作用产生的。乳酸导致的低pH会抑制细胞的生长。控制丙酮酸氧化成乳酸的策略包括抑制LDH。LDHA残酶活性11-25%的降低可将乳酸生成降低到79%从而不影响细胞的增殖和产率。此外,LDH和丙酮酸脱氢激酶(PDHK)同时下调可以减少乳酸含量并且增加单位体积的抗体产率。Jeong及其同事利用另一种方法特异性敲出基因,使用LDH反义mRNA证明LDHA活性的消失,成功消除了CHO细胞培养过程中因环境酸化引起的细胞凋亡。因此,相较于没有基因改造的对照组细胞,稳定表达LDH反义mRNA的细胞拥有低水平的线粒体功能紊乱,细胞色素C的释放以及半胱天冬酶-3的活性。值得注意的是,近期有研究证明LDH的完全敲除对CHO细胞是致命的,甚至连PDHK-1,2,3的表达都随之下调,这也是通过完全基因敲除策略提高部分细胞表型时值得注意的地方。

3.3.4 RNAi-介导的细胞骨架动力学和细胞周期检测点激酶的调控

众多研究表明动物细胞工厂产量的差异主要来自于高产株中细胞骨架的异常调控。细胞骨架动力学的影响能够通过基因工程手段从细胞分裂,胞内物质交换,细胞稳定性和分泌方面提高产药物细胞的表型。在重组CHO细胞基因扩增的蛋白组学方面,丝切蛋白(CFL1),一个肌动蛋白骨架的关键调节蛋白,被证明可以通过10倍细胞特异性的SEAP(分泌型碱性磷酸酶)产率的增加进行下调。相应的,瞬时siRNA介导的CHO细胞中CFL1的敲除引起重组蛋白产率提高80%,而CFL1的下调分别引起细胞SEAP产率65%的提高和tPA产率47%的提高。虽然细胞骨架动力学的调节对提高CHO细胞表型有积极作用,它对动物细胞工厂基因工程方面仍有消极的作用。

因为这些调节蛋白控制着细胞周期的程序以及增值,所以需要利用宿主细胞工程将细胞周期检测点激酶以及其他目标靶点得以处理。Lee及其同事最近报道了一个令人兴奋地研究,通过RNA干扰技术将CHO DG44细胞中的细胞周期检测位点激酶共济失调毛细血管扩张以及Rad3相关表达沉默。产单抗CHO细胞中ATR的下调可以使利用MTX筛选克隆的速度加快。作为处理细胞中MTX介导的DNA复制压力的结果,细胞周期检测点调节子如ATR会抑制细胞周期。结合这一点,加速细胞修复的可行性被如下事实证明:ATR抑制剂能够抑制MTX介导的细胞周期阻断。

3.4 依赖microRNAs的细胞通路工程

在过去的几十年,产生物医药产品的细胞基因工程一直关注于操纵信号目的基因。然而对于细胞表型的改变,一般通过改变多个相关的相同或不同通路的基因而不是改变单独一个基因的表达,通过对所有信号通路的改造可能会提高表型结果。microRNAs最近被广泛应用于CHO细胞工程中,因为这些内源性的小RNA可以调控所有的细胞通路。有趣的是,最近实验室研究发现大部分miRNAs能够伴随调节多个不同的细胞通路以保持细胞内稳态。这一特性使miRNAs成为一种未来用于宿主细胞工程中的非常有效的分子工具。然而,大量的miRNAs仍然需要在CHO细胞中进行功能性评价以评价其对表型的影响。结合这一点,高通量的功能性miRNA筛选方法,miRNA组学性能学习将有助于寻找用于CHO细胞工程的新型目标分子。在接下来的部分里,详尽的介绍了miRNAs的生物起源和功能,以及已经报道的前沿的将miRNAs技术用于CHO细胞中的研究。

3.4.1 miRNA生物起源与功能

1993年首次在秀丽隐杆线虫中发现严格调节子,miRNAs在整个多细胞生物的细胞过程中的基因表达微调方面扮演了十分重要的角色。进一步的研究证明了miRNAs的另一个附加功能,在(表观遗传学)转录基因沉默方面可以直接编辑抑制DNA启动子的抑制子。特别的,大部分miRNAs都严格根据物种而进化因此表明其在细胞调控方面的重要角色。miRNA主要的基因是通过RNA聚合酶II(POLII)将其变为早期miRNA转录子(pri-miRNAs)而转录的,其包含侧面含有很长上下游基因序列的发卡结构。第一步,pri-miRNA转录子拥有包含DROSHA以及其辅因子DGCR8的(先天性胸腺发育不全综合症临界区)RNA酶-III复合物的核,DROSHA/DFCR8能够将旁侧序列分开从而产生60-80 nt长度的miRNA发卡结构前体。Pre-miRNAs通过输出蛋白-5(XPO5)从细胞核分泌到细胞质中(Lund, 2004),另一个叫做DICER的RNA酶III将环状序列从pre-miRNA转移到19-25 nt的miRNA二倍中间体。随着miRNA二倍体中间物的解螺旋,DICER将伴随链转移到途径基因(AGO)蛋白家族成员1-4上,同时与单链成熟miRNA向导链结合。AGO代表微型核糖核酸酶复合物的核心蛋白,被称为miRNA-诱导的沉默复合物(miRSC),它可以通过转录抑制或者mRNA降解使基因沉默。合并miRNA引导miRISC到mRNA位点,miRNA一般与3’-UTR结合从而导致翻译后修饰基因沉默。最近研究表明miRNA目标的识别通过揭示大量的非顺序miRNA:mRNA结合最终增加一个复合物到早期已知的同位miRNA功能区。目标片段不完美的天性降低了其独立miRNA的特异性,允许单链miRNAs微调上百种不同目标基因。值得注意,成熟miRNA的5’-末端2-8号位点的核酸形成所谓的种子序列,它是为了与目标mRNA区域严格结合。拥有可识别种子区域的miRNA被编为家族。然而,来自于同一种子家族的miRNAs拥有惊人的不同的胞内功能,并且miRNA功能高度依赖于转录蛋白的组成,这阻碍了单独miRNAs在功能上的分类。值得注意,大约50%的动物miRNA轨迹与其他miRNA十分接近,这使miRNA群得以产生,它们由多顺反子性的转录单位转录而来。

3.4.2 CHO基因组中mRNA序列的识别

利用接下来产生的RNA测序技术,在不同CHO细胞系及培养条件下的全部RNA序列中有307个成熟miRNAs和200个pre-miR序列已经被发现。这些miRNA序列接下来被标注为cgr-miRNAs而公开发表miRNA序列信息被称作miRBase。最近,硅胶公司对CHO基因组中的miRNA进行重新测序发现新增71个成熟miRNAs。这些发现将当今已知的成熟miRNA库的容量增加至378个。然而,与人类和小鼠相比,较低数量的miRNAs表明灰仓鼠中的miRNAs的实际数量可能更高。在miRNAs数量上的不符合性部分原因可能是灰仓鼠(22条染色体)相较于人(46条染色体)和老鼠(40条染色体)较少的染色体造成的。此外,这也可能是CHO细胞中遗传性基因不稳定的结果,作为miRNA序列中的单核苷酸变异体,其会导致功能的完全丧失,并且不同的CHO细胞系在同一个实验室中进行培养也会表现出戏剧性的核型的差异。然而,基因组序列实验也建议仓鼠和小鼠的全部基因信息具有极强的可比性。

在前基因组领域,不同的用于功能性miRNA分析的策略已经被找到,例如瞬时转染miRNA类似物或者编码嵌合miRNA前体发卡结构的人造表达的质粒。然而,2011年前基因组序列信息的缺失实质上阻碍了CHO细胞中miRNA的研究。而且,嵌合miRNA表达载体被证明不适用于内源性灰仓鼠中miRNA序列的载体编码。

3.4.3 miRNA组的分析对CHO细胞中生物过程相关目的miRNAs识别的影响

一个理想的生物过程包括前期较高的细胞增殖速率而得到的较短生长期,而细胞非生长期维持的时间越久越能得到高的产率。一种常用于该目的的策略是培养过程中二阶段降温。在对数生长期的末尾降温从而延长反应器培养时间,最终提高产物产量。对降温积极性的评估是将miRNA建立于异种芯片上,结果显示标准批培养的稳定期降温能够使miR-21和miR-24基因上调。在另一个研究中,不同的miRNAs被证明随着温度的降低而下调。六个miRNAs(miR-219,miR-518d,miR-126,miR-30e,miR-489以及miR-345)被证明明显上调,四个被证明显著下降(miR-7,miR-320,miR-101,miR-199)。Druz等人研究在新鲜以及氮源耗竭的培养基中使用异种芯片的方法进行培养的CHO细胞中不同miRNA的表达。结果表明在饥饿引起的细胞凋亡中全部miR-297-669群都被上调。特别的,miR-297-669群中28个miRNA成员中,18个miRNA被证明在培养基耗竭的条件下被上调,虽然这些数据很早就指出在CHO细胞中存在miR-297-669群,且在灰仓鼠基因组中的准确位置仍然没有被证明,但是由于目前正在重新检测CHO基因组中新增miRNA序列因此或许不久的将来就能够知道具体的位置信息。在一种联合检测悬浮培养CHO-K1细胞中mRNA和miRNA表达的方法中,超过1400个mRNAs和100个miRNA被证明在延滞期、对数期和稳定期表达不同。最终,通过对比高产和低产细胞株中miRNA的表达,更多的miRNA被识别具有潜在调节不同蛋白的表达和分泌。这些结果强调在培养过程中转录组和miRNA组的动力学平衡。

3.4.4 CHO细胞中功能性miRNA的评估方法

miRNAs在动物细胞转录组调解中扮演着一个重要的角色,并且这是通过基因工程方法提高CHO细胞性能的候选。这有许多可考虑的依赖于miRNA的途径,比如蛋白产生机制,分泌途径,细胞周期,代谢以及由细胞凋亡引起的细胞死亡、坏死或者自吞噬作用。图2D展示了早前提到的miRNAs在提高CHO细胞株性能方面的作用。为了将增加的知识用于miRNA的研究,一系列关于miRNAs功能性提高从而加强CHO细胞性能的研究得以开展。这些导致能够对CHO细胞表型有利影响的潜在miRNAs的早期列表的形成(Table 4)。然而,由miRNA性能研究的报道数据需要统一,从而能够进行由miRNA作用引起的理想型功能性的确认。基于运动期望模型,胞内丰富的miRNA过量或者抑制分别会导致目标基因的减少或者增加。在动物细胞培养中通过引入稳定的小RNA二倍体,被称为miRNA类似物,能够导致瞬时miRNAs的过表达,因此增加内源性miRNA的功能。为了增加那些对细胞特性有有利用影响的miR种类,这有几种技术可以实现这一目标。通过整合miRNA前体序列到宿主细胞基因组上,可以实现稳定miRNA的过表达。随着细胞的内源性miRNA生物起源途径,导入的miRNA被转录并且通过结合到目的mRNAs而表现出它的调节功能。pre-miRNA序列既可以通过对宿主细胞基因组使用特异性miRNA前体的PCR方法得到,也可以通过化学法合成。miRNA序列克隆在报告基因的5’-UTR或者3’-UTR端(如GFP,抗生素抗性基因或者两者的融合)。重要的是,序列必须满足正确DICER过程的关键需求,也应该包含严格决定功能性的内源性loop序列。当将目标pre-miR序列亚克隆于正确的动物细胞表达载体上后,质粒DNA被转染进入选定的重组产物的细胞株中。相较于miRNA过表达,通过使用被称为miRNA抑制剂或者miR拮抗剂的特异性反义寡核苷酸能够得到细胞miRNAs的短时抑制。拮抗剂是化学稳定的单链RNAs,它们能够直接结合到目标miRNAs上,miRs拮抗剂是补体。内源性miRNA的稳定抑制在CHO细胞表现上具有消极作用,因此在宿主细胞优化中使用miRNA代理了一种可选择的方法。miRNA消除或者诱导分子,它们是报告基因如绿色荧光蛋白(GFP)能够通过3’-UTR存在于多个miRNA结合位点,能被用来稳定抑制细胞中大量存在的miRNA。二者择一的方法用于miRNA过表达或者抑制包含病毒的载体如腺相关病毒(AAV),逆转录病毒或者腺病毒载体。AAV载体代表着用于基因治疗最多的病毒载体,并且已经成功被用来在体内或者体外将多种基因转换入不同的细胞中。然而,仍然没有研究报道描述AAV载体和CHO细胞之间的相容性,其代表了转染效率以及诱导稳定转基因表达的能力。虽然慢病毒介导的miRNA过表达是基础研究中常用的方法,但是在CHO细胞中过表达miRNA还没有被报道。值得注意,我们已经能够利用慢病毒载体快速产生稳定的miRNA过表达的CHO细胞株,既可以通过CHO细胞的稳定过表达或者抑制凋亡前体miR-137(Fischer等未出版)。然而,凋亡不能够通过稳定敲除miR-137基因得以抑制。此外,我们不能够建立关于凋亡前体功能miR-137-3p的稳定miRNA过表达细胞池。然而,这仍表明慢病毒转染速率表现出很高的成功率。虽然如此,这仍表明病毒载体可能是一种用于CHO细胞miRNA研究的有价值工具以快速产生重组miRNA过表达细胞。

3.4.5 通过miRNAs调节因凋亡引起的细胞死亡

为了延长培养时间并且使细胞适应充满压力的反应器培养环境,回避凋亡是一个在宿主细胞工程中经常需要达到的目标,因此也是miRNA研究的有趣课题。在上述提到的miRNA研究由Druz及其同事完成,miR-466h被发现用于诱导因处于营养缺乏培养基而饥饿的CHO细胞凋亡。因此,shRNA-介导的在CHO-SEAP细胞中凋亡前体miR-466h前体的基因敲出能够延长培养周期并且增加活细胞密度积分,因此抑制凋亡产生的攻击。该作者展示miR-466h前体的基因敲出导致5个抗凋亡基因的上调(BCL2L2,DAD1,BIRC6,STAT5A以及SMO)。通过目标miRNA生物信息学预测工具,发现所有这些基因都位于假定的miR-466h目标位点上的3’-UTR,表明这些基因很有可能代表着CHO细胞中miR-466h-5p的直接目标。最近,Kelly等稳定下调了CHO-SEAP细胞中凋亡前体miR-34a。出乎意料,工程细胞并没有免于凋亡但是表现出了细胞比生长速率的增加。如miR-137所展示出的,这些结果表明稳定抑制miRNA的功能可能不会总是可以得到理想的表型。同时,新引进的基因编辑技术如CRISP/Case9系统将无疑成为一种用于稳定敲除miRNA得到优化设计的CHO细胞的有吸引力的工具。

3.4.6 miRNA-介导的重组蛋白表达的加强

Barron及其同事发现CHO细胞中miR-7a-5p表达水平随着温度的降低而降低。始料未及,miR-7a-5p模拟物的在CHO细胞中的导入降低了细胞增殖速度,但是增加了细胞SEAP的比生成速率。相反的,虽然CHO细胞中miR-7a-5p的瞬时抑制并没有诱导理想表型,miR-7a的稳定抑制增加了培养周期并且因此提高了单位体积的SEAP表达水平。相似的争论结果同样被Loh等报道,相较于低产细胞株,在高产细胞株中发现miR-17-92a群被下调。令人意外的,miR-17-92a群成员的稳定过表达而不是抑制,能够加强单抗的比生成速率。这些被Jadhav及其同事发现的结果线性很好,它们发现miR-17-5p的稳定过表达可以将CHO细胞中重组蛋白的表达增加三倍。Strotbek等引领了高通量miRNA的筛选方法,用于发现能够提高CHO细胞中抗体产量的miRNAs。这种瞬时筛选能识别出好的用于增加单抗产量的miRNAs,关于人编码miRs,has-miR-557R-557和has-miR-1287,当它们在CHO细胞中稳定过表达后能够积极的影响生长以及细胞的比生成速率。最近,一个十分综合性的研究显示非预想的大量的miRNAs影响着不同的生物技术与细胞功能如蛋白生产,细胞生长、凋亡以及坏死极其相关。有趣的是,作者们报道所有的miR-30家族贡献于加强CHO细胞中重组蛋白的表达,这甚至可以归结于细胞比生产速率的提高。此外,miRNA的研究为CHO细胞中组蛋白脱乙酰酶(HDAC)活性的调节提供了新的视野,miR-2861的翻译后修饰下调了CHO细胞中HDAC5的表达。因此,miR-2861被识别作为一种新的CHO细胞中的miRNA,其能够被用来作为一种蛋白产物的加强子而对产物质量没有负效应。此外,通过稳定沉默CHO细胞中miR-23的表达,可以调节氧化代谢和线粒体的活性,从而将SEAP蛋白的比生成产率提高三倍。识别miR-23目标基因包括LETM1和IDH1,表明miR-23能够被用来改变CHO细胞的生物能源产生方向,为了加强重组蛋白的生产。最近被Emmerling及其同事强调,miRNA作为强有力的细胞工程工具是有极强潜力的。一个跨学科的方法,研究产rAAV的HeLa细胞以及产单抗的CHO细胞中对轻度低温响应的不同miRNA的表达,识别出miR-483在两个生产系统中的细胞产率关键调节子。然而,所有这些例子都仅仅只是大量新增miRNA中的一个开始,而那些适合于产生物药物的宿主细胞工程的miRNAs将很快会被发现。

4
总结

30年来,基因工程一直作为功能性CHO细胞生物学中的一门强大而多功能的手段,以稳步提高CHO制造细胞的培养性能。有趣的是,尽管在2011年之前不能给CHO细胞基因组DNA测序,但是生物工程师已经通过过表达其他物种的优势基因产物,在产生更优秀的CHO细胞系方面取得了明显的进步,这些其他物种被认为拥有CHO细胞的保守功能。通过下一代测序,CHO和中华仓鼠基因组的破解最终促进了高效基因组编辑工具的可应用化,从而促进了定制生产CHO细胞株的发展。值得注意的是,由于近年来对CHO细胞中(小型)非编码RNA研究的显著增加,这一领域即将取得的成果也将充分的支持功能基因组学来提高生产型细胞,大大地增加了细胞中的工程目标。考虑到最大活细胞密度的显著提高和大于10 g/L的体积产量部分是源于理性CHO细胞工程,所以整个细胞工程被认为是成功的。

5
展望

CHO细胞工程一直以来都是被生物制药工业的实际需求驱动的,目的是基于生物过程消除哺乳动物细胞中的阻碍。面对将来的需求,我们将面对哪些问题,如何解决这些问题来满足工业的需求?当然,在大多数制药公司目前的药物中,典型的单抗药物会渐渐地被新分子药物所取代,比如(难以表达的)抗体片段或是人工片段,这些药物从不可能经过数十亿年的革新。这将持续挑战CHO细胞株的开发,并且需要CHO细胞工程提供适当的解决方案。与此同时,仍然需要创新研究来维持高效的制造过程。然而,基因组编辑技术的显著进步,如CRISPR/Cas9工具,下一代测序与系统生物技术学的结合,都在发现与调节新细胞工程目标方面展现了非凡的潜力。这些努力都将为宿主细胞的理性设计铺平道路以满足未来高效生物技术的需求。

参考文献:

Fischer S, Handrick R, Otte K.The art of CHO cell engineering: A comprehensive retrospect and future perspectives.Biotechnol Adv. 2015 Dec;33(8):1878-96.

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